Giải pháp chống virus gây bệnh đốm trắng

Thiết kế thí nghiệm

Các nhà khoa học đã thành lập một nghiên cứu đánh giá hiệu quả của sợi kép (ds)RNA ở gen vô định hình là orf89 và wsv191 so với hai gen định hình vp26 và vp28 của virus đốm trắng để chống lại WSSV trong cùng điều kiện thí nghiệm.

Các nhà khoa học tiến hành lấy tôm thẻ chân trắng giống từ một trại giống ở Sonora, Mexico đã được xét nghiệm PCR cho kết quả âm tính với WSSV. Các con tôm này được nuôi trong môi trường thí nghiệm với độ mặn 25‰, nhiệt độ 27 ± 2⁰C và được sục khí liên tục. Định kỳ thay 50% nước với 3 ngày/lần để duy trì chất lượng nước. Sau đó, những con tôm này được tiến hành gây nhiễm từ tôm bị WSSV ngoài tự nhiên từ Sinaloa, Mexico với nồng độ được pha loãng từ 102 - 107. Tiến hành tiêm để gây nhiễm WSSV cho tôm và nuôi trong môi trường thí nghiệm ở bể có thể tích 12 lít. Sau đó, thực hiện theo dõi các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ chết của tôm nhiễm WSSV trong 10 ngày với tần suất kiểm tra là 2 lần/ngày. Nồng độ nhiễm bệnh và khả năng gây chết được xác định tương ứng là 105.6 SID50/ml và 105.6 LD-50/ml. Ở nồng độ SID50 tỷ lệ tôm bị nhiễm bệnh là 50%. LD-50 là liều duy nhất gây chết đến 50% nhóm tôm thí nghiệm.

RNAi (RNA can thiệp) chống lại WSSV gồm bốn gen vp26, vp28, wsv191 và orf89. được sản xuất như là dsRNA, sử dụng bộ phiên mã đã được quy định.

Phương pháp điều trị

Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên các nhóm khác nhau, mỗi nhóm gồm 10 con TTCT đã gây nhiễm WSSV được theo dõi trong 24h và được nuôi trong bể có độ mặn 25‰, nhiệt độ 25 ± 2⁰C, sục khí liên tục. Mỗi nhóm được tiêm lần lượt vào cơ thể với một trong những dsRNA với liều 4 µg.

Một nhóm 10 con TTCT được tiêm với liều lượng 40 µl dsRNA của vi khuẩn lacZ và được sử dụng làm nhóm đối chứng. Một nhóm khác gồm 10 con tôm được điều trị bằng 40 µl hệ đệm phosphat và sử dụng làm đối chứng chuẩn. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Sau 48h, tất các con tôm nhiễm WSSV trong bể thí nghiệm tiếp tục được tiêm vào cơ thể với liều cao (2.500 SID50trong 50 µl). Tôm được theo dõi để ghi lại các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ chết của bệnh với tần suất 2 lần/ngày trong vòng 10 ngày. Số lượng tôm gần chết và chết được ghi lại. Sau đó được lấy ra bể thí nghiệm và tiến hành lấy mẫu mô nhiễm WSSV để kiểm tra. Vào cuối thí nghiệm, những con tôm sống sót được sử dụng để tách chiết RNA và phân tích PCR với WSSV. Các hiệu quả kháng virus của dsRNA khác nhau được đánh giá bằng tỷ lệ chết và số lượng tôm bị nhiễm WSSV.

Hình 1: Tỷ lệ tử vong ở tôm được điều trị bằng dsRNA của 4 loại gen chống lại WSSV so với nhóm đối chứng sử dụng dsRNA của vi khuẩn LacZ và một nhóm không bị nhiễm WSSV/không được điều trị bằng dsRNA.

Các kết quả

Nhóm thí nghiệm và điều trị tôm nhiễm WSSV bằng dsRNA của vi khuẩn LacZ là nhóm đầu tiên cho thấy các dấu hiệu lâm sàng ở tôm như giảm ăn, bơi lội thất thường, lờ đờ sau 24h tiêm. Tỷ lệ chết đầu tiên được ghi nhận sau 36h, và tỷ lệ chết 100% sau 108h, tất cả tôm xét nghiệm PCR đều cho kết quả dương tính với WSSV (hình 1).

Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen vp28, cho thấy tôm chết đầu tiên sau 72h và tỷ lệ tôm sống sót còn lại là 7%. Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen orf89, cho thấy tôm chết sau 108h và tỷ lệ tôm sống sót vào cuối thí nghiệm là 10%. Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen vp26, cho thấy tôm chết đầu tiên sau 84h và tỷ lệ tôm sống sót vào cuối thí nghiệm là 21%. Đối với nhóm được sử dụng dsRNA của gen wsv191, cho thấy tôm chết đầu tiên là sau 24h và tỷ lệ tôm sống sót vào cuối thí nghiệm là 83%. Tất cả những con tôm chết đều cho kết quả kiểm tra PCR dương tính với WSSV. Những con tôm còn sống sót không hiển thị các dấu hiệu lâm sàng của bệnh WSSV và cho kết quả âm tính với WSSV khi xét nghiệm PCR.

Đáp ứng kháng virus

Một liều dsRNA duy nhất với lượng 4µg/tôm là đủ để kích hoạt để gây ra phản ứng chống lại virus WSSV. Với các kết quả thí nghiệm trên có thể thấy, hiệu quả của việc tiêm dsRNA giúp ức chế sự sao chép virus và giảm tỷ lệ chết ở tôm được điều trị. Vào cuối thí nghiệm, hầu hết những con tôm được điều trị để chống lại WSSV bằng sợi RNA mạch kép đều sống sót và có tỷ lệ nhiễm WSSV thấp. Ngược lại, tôm được điều trị bằng chuỗi RNA mạch kép độc lập của vi khuẩn LacZ bị nhiễm WSSV và chỉ sống sót được trong một thời gian ngắn.

Tôm được điều trị với dsRNA của vp28 và vp26 có khả năng chống lại được virus WSSV. Do gen vp28 và vp26 có khả năng mã hóa các protein cấu trúc VP28 và VP26, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và khả năng lây nhiễm của virus.

Khi sử dụng RNA mạch kép của hai gen phi định hình orf89 và wsv191 để chống lại WSSV cho thấy rằng: gen orf89 đã có hiệu quả tương tự với gen cấu trúc vp28 trong việc làm giảm khả năng nhân rộng của virus và giảm tỷ lệ chết ở tôm. Ngược lại, dsRNA của gen wsv191 có tác dụng chống lại virus kém nhất trong bốn loại gen được sử dụng trong thí nghiệm.

Kết luận

Dựa vào các chức năng mã hóa của 2 protein vô định hình có thể giúp giải thích sự khác biệt trong hoạt động kháng WSSV. Gen orf89 quy định việc ngăn chặn quá trình sao chép của virus và mã hóa protein của virus. Vì vậy, gen này đóng vai trò thiết yếu đến khả năng nhiễm và nhân rộng virus của tôm. Ngược lại gen wsv191 không phải là một gen thiết yếu trong việc nhân rộng WSSV, mặc dù thực tế nó có thể mã hóa hoạt động của cả DNAse và RNAse. Sự tác động của nó không có ý nghĩa đến việc ức chế sự sao chép của virus. Tuy nhiên, do tôm không có hệ miễn dịch đặc hiệu nên việc áp dụng nó vào thực tiễn sản xuất vẫn còn là một vấn đề gây tranh cãi cho các nhà khoa học.